組織培養技術::植物基因轉殖方法

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基因轉殖方法

詹明才 ( 副研究員 )

電話 : (02) 2789-8625

E-mail : [email protected]

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所在位置：化學所 A304

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學經歷

1992 Ph.D. Dept. of Agronomy, National Taiwan Univ.

1992–1998 PDF Inst. of Molecular Biology, Academia Sinica

1998 - 2003 Assistant Research Fellow

2003 - present Associate Research Fellow

研究方向:

抗環境逆境基因轉殖及環境逆境訊息傳導研究:

生物性與非生物性因子是降低全世界農業產量的最主要環境因子。對植物的生長發育而言，最典型的環境逆境就是不同程度的溫度逆境。傳統育種的方法受限於逆境忍受力的複雜度、植物基因體中有限的遺傳變異以及缺乏有效的篩選技術。但是，傳統育種仍然提供了一些成功的例子，例如增加亞熱帶水稻品種對低溫的耐受力，使得這些品種即使在非常寒冷的區域也能夠生長。而另一方面的研究則利用了在分子生物學上的知識，針對於有用的、可以耐環境逆境的基因加以應用。因此我們希望能夠以現有的知識及植物基因轉殖技術，針對植物的環境逆境做一分子層次上的研究。雖然目前有很多不同作物的基因轉殖技術已經被建立了，但在尋找有效可抗環境逆境的基因上仍嫌不足。在眾多各種可能的抗逆境基因中如果試著分別一一去轉殖到植物內，再測試它抗逆境的能力，則不僅曠日廢時並且耗費人力，因此如何去建立一快速的植物基因功能性分析技術仍是有其必要性。目前針對植物面對逆境後，它細胞內訊息傳遞的過程是如何進行以適應環境仍不夠清楚。目前我們可以透過互補性 DNA （ cDNA ）的存在知道特定基因的表現程度，現今眾多的 cDNA 選殖株已經可以被點在一個很小的盤內，進行微矩陣分析以利在短時間內得到大量不同表現量 cDNA 的資訊。我們希望建立蕃茄微矩陣系統，並利用阿拉伯芥的微陣列系統，以確認並了解植物對於逆境下基因反應的機制。此外，我們企圖藉由得到的結果，發展一套植物在遭受環境逆境時，基因訊息傳導的途徑，這些資訊將有助於未來探討植物處於逆境下所發展出來各種反應。另外，我們也將選殖這些在早期逆境下所誘導出的基因，一旦被選殖出的有用基因，進而定序、分析並轉入蕃茄，以獲得耐逆境轉殖株。

文心蘭新穎品種的育成與基因轉殖的應用::

我們已經建立文心蘭的基因轉殖系統，利用 GUS 報導基因，我們可以重複地獲得基因轉殖文心蘭植物。這些基因轉殖植物經過分子生物檢定技術證實外來基因已經嵌入植物染色體組中並且表現出來。同時我們利用這個系統也獲得耐軟腐病的基因轉殖文心蘭，這些植物也都證實外來基因已經嵌入植物染色體組中並且表現出來。同時我們利用造成文心蘭軟腐病的病原 Erwinia 做植株抗病試驗，證實這些植物可以抵抗軟腐病。我們不僅利用農桿菌系統建立了轉殖系統，也利用基因槍系統建立轉殖文心蘭的程序。這兩種系統都可以獲得基因轉殖植物。最近，我們建立了新穎的蘭花基因轉殖篩選技術，希望配合已經建立的基因轉殖系統，將有用的花色或延緩老化或調節開花時期的基因轉入文心蘭中，來育成新穎的文心蘭品種。

詹明才 （ 2004 ）第一部份基因轉殖技術 第四章單子葉作物 第一節水稻之基因轉殖技術。 In: 植物基因轉殖與分子檢測技術。植物生物技術教學資源中心主編。台中，台灣。 Pp. 135-148.

詹明才 （ 2004 ）第二部份分子檢測技術 第三章轉基因植物之分子檢測技術 第七節生物晶片。 In: 植物基因轉殖與分子檢測技術。植物生物技術教學資源中心主編。台中，台灣。 Pp. 285-297.

基因槍法::

基因槍又稱粒子槍，原理：是將 DNA 包覆在直徑約 1 – 1.6 μ m 金粒子上，再藉由氦氣推動，將金粒子射入植物細胞，粒子槍法對植物種類與組織細胞都沒有選擇性，適用範圍非常廣，但是對每種材料要找到最合適的培養系統，了解其植株再生的途徑及選擇有高度再生能力的細胞，或調整培養條件，使具再生能力的細胞數目增加，然後針對這些細胞進行轉殖。此外粒子槍法得到的轉基因拷貝數較高，容易干擾基因的表現。

Microparticle bombardment

農桿菌法

農桿菌法的原理：農桿菌中有 Ti 質體 (tumor inducing plasmid) ，質體中有一段 T-DNA ，會穿過受傷的植物細胞壁，進入植物細胞核內，並且併入植物基因組，受感染的植物會出現腫瘤，因此若將 Ti 質體中導致腫瘤的基因切除，置入擬轉殖的基因，即為 優良的轉殖系統。農桿菌法轉殖效率高，而且得到的轉基因拷貝數較低，常為 1 – 2 拷貝數。初期農桿菌法只能適用於雙子葉植物，經許多重要的改進後也能用於單子葉植物。首先是使載體中的 virG 蛋白質大量表現，可提高水稻、玉米、及樹薯等不易轉殖植物的轉殖效率，其他因子包括農桿菌菌種與植物間的配合，在轉殖時處理 vir 基因的誘導物質，例如 acetosyringone 、糖類、餵養細胞、或受傷細胞萃取液等；此外培養基 pH 值、溫度、細胞及菌液濃度、光線強度、培養時間、培植體種類、培植體狀況、荷爾蒙處理與否、刻傷處理，與適當的抗氧化劑、乙烯形成抑制劑、或甲基化形成抑制劑等因子，都對農桿菌的轉殖效率有相當程度的影響。不過農桿菌轉殖的變動條件太多，每一 種植物應該分別建立各條件的最佳組合。

Agrobacterium tumefaciens -mediated plant transformation.

化學突變法

甲基黃酸乙脂（ EMS ），氮芥 (NM) ，等都屬於烷化劑，它們的作用是使鹼基烷基化， EMS 使 G 的第 6 位烷化，使 T 的第 4 位上烷化，結果產生的 O-6-E-G 和 O-4-E-T 分別和 T 、 G 配對，導致原來的 G ∶ C 對轉換成 A ∶ T 對； T ∶ A 對轉換成 C ∶ G ，造成突變。

農業生物技術中心

陳鵬文 助理教授

先修科目：分子生物學

課程名稱：植物基因轉殖學

(Gene transformation of Plant)

一、教學目標：

此課程的內容著重於植物基因轉殖技術之介紹，以及如何利用分子生物學及生物技術來進行相關應用之研究工作。目的在於使同學對於植物基因轉殖技術的基本理論有深入的瞭解，並對於植物基因轉殖技術在農業生物科技的基礎研究與實際應用上能有所認識。進一步引發同學對於植物基因轉殖技術之興趣。

1. 王升陽等作；植物生物技術教學資源中心主編， 2004 ，植物基因轉殖之原理與應用，植物生物技術教學資源中心教育部顧問室出版。

2. 王曉俐等作；植物生物技術教學資源中心主編， 2004 ，植物基因轉殖與分子檢測技術，植物生物技術教學資源中心教育部顧問室出版。

3. 張玉瓏等編著， 2003 ，生物技術，新文京開發出版股份有限公司出版。

教學內容及進度：

1. 前言

2. Recombinant DNA

3. 常用的分子生物學技術

4. 農桿菌與葉綠體基因轉殖技術之原理與研究

5. 基因槍與電穿孔基因轉殖技術之原理與研究

6. 植物病毒與桿狀病毒基因轉殖技術之原理與研究

7. 花粉基因轉殖技術之原理與研究

8. 植物基因轉殖技術之應用

9. 二十一世紀之分子農場之研究

植物基因轉殖

在作物改良上之應用

台中區農業改良場／蔡奇助

基因轉殖的理論與發展

自從 1953 年華生與克立克發現 DNA 雙股螺旋結構後，奠定日後 DNA 重組技術。至 1970 年 代，細菌中之質體 DNA 大量被應用在重組 DNA ，加速基因重組的研究。 1980 年代後重組 DNA 與組織培養之技術整合，造就往後基因轉殖的蓬勃發展。而且在生物化學、遺傳學及細胞學 之進步下， 1985 年聚合  連鎖反應誕生，由於此技術操作簡單、迅速。因此，已被大量應用 在各個生物相關領域，且皆能有突破性的發展。應用於基因轉殖上，更加速此領域之發展。 基因轉殖對新品種的育成，極具潛力。目前已有許多經基因改造的作物已育成，且商品化， 在末來的發展指日可待。

基因轉殖之進行共可分三個階段：

( 一 ) 將有興趣的基因 ( 或稱目標基因 ) 先行修篩包裝。簡 單的說是將有興趣的基因 (DNA 片段 ) 從某種源之基因組分離出來，再將之接於易操作的質體 DNA 中。 ( 二 ) 將包裝好的基因送入植物細胞中，使之能進入植物細胞之染色體 (chromosome) 中，使之能穩定存於細胞中。 ( 三 ) 鑑定及篩選已轉殖成功之細胞或植株。上述三個過程中， 有興趣之基因的包裝與轉殖成功細胞或植株之篩選方式較固定，而如何將包裝於質體 DNA 中 的基因送入植物細胞中的方式就有很多種，分述如下：

農桿菌轉殖法

自然界中之植物農桿菌 ( 或稱腫瘤菌， Agrobacterium spp.) 之細胞內含有會使植物產生腫 瘤之質體，稱之 Ti 質體 (tumor inducing plasmid) 。這種質體會在農桿菌感染宿主植物時嵌入植 物的染色體 DNA ，達成穩定的基因轉移。因此，只要事先將目標基因插入 Ti 質體，且將 Ti 質 體中會造成植物產生腫瘤的基因去除，即能有效達成基因轉殖之目的。

電穿孔處理法 (electroporation)

此技術乃將植物組織浸於大量目標 DNA 溶液中，通以瞬間高電壓之直流電，此時細胞即 很容易吸收大量外來的 DNA 。但進行此技術時，需先將植物之細胞壁除去，以原生質體的形 態進行，待轉殖成功再利用組織培養使之再生。

花粉管導入法

1983 年中國科學院 周光宇 教授首創，利用針筒將目標 DNA 直接由柱頭注入，再篩選種 子，即可得轉殖成功之植株。

粒子槍導入法

將載有外來基因的質體核酸包以高密的鎢粒子 (~1um) ，使之成一微小物體，用粒子槍 (particle gun) 高速打入植物細胞中，經組織培養篩選，即得轉殖植株。

微量注入法 (microinjection)

此法於顯微鏡下，使用毛細管將外來基因直接注入生物細胞之原生質中，經組織培養， 即得轉殖植株。

上述幾種轉殖技術中，以農桿菌轉殖法與粒子槍導入法所得到的轉殖植株較穩定，且已 廣泛運用於植物之基因轉殖上。

植物基因轉殖在作物改良上之應用

自然界中的生物資源即是一座龐大的基因庫，有各式各式的基因存在，各種基因扮演著 不同的角色，我們可以利用基因轉殖技術將甲生物之有用基因移至乙生物上，以達成作物的 性狀改良。由於基因沒有分彼此，不管目標基因是來自動物、植物或微生物等，皆可將之利 用，改善農作物的性狀，突破種間隔離，對育種來說是一大革新。

因此已有許許多多有用的 農藝或園藝性狀的基因，已在進行基因轉殖之研究，  分述如下：

抗蟲基因之轉殖：

自然界中有些物種原本對昆蟲即有抗性，這些物種的抗性來自其內在的抗蟲基因。若能 將之分離、選殖，並轉殖於農作物上，可以降低殺蟲劑的使用，既節省成本，又可減低對環 境的污染。如蘇力菌的殺蟲基因，此係蘇力菌在產孢時期會產生結晶毒蛋白，這類結晶蛋白 經昆蟲腸道內高鹼性及蛋白質鋂作用，分解成毒素，殺死昆蟲。而且這種結晶毒蛋白對人體 並不會造成傷害，因此自 1990 年後已大量被轉殖於作物上，以增強作物之抗蟲性。另外，尚 有許多植物之抗蟲基因被分離、選殖，如蛋白  抑制劑 (proteinase inhibitor) 之基因，由於昆 蟲腸道內存有蛋白鋂，若將此酵素抑制，昆蟲即因不能分解蛋白質來利用而死亡。上述蛋白 鋂抑制劑經煮熟後即可破壞，因此亦是一種有效，且可供應用的抗蟲基因 ( 如圖 ) 。

圖、從甘薯分離、選殖之胰蛋白鋂抑制劑基因，經農桿菌轉入菊花阿來粉品種，在抗生素培 養基篩選下，所得初步擬轉殖植株 (A) ；未經轉殖之組織無法在含抗生素之培養基生存 (B) 。

抗病基因之轉殖:

抗病基因的分離、選殖亦進步很迅速，其中較常利用的是反義 (antisense) RNA 基因技 術，與植物病毒交互保護理論等。反義基因乃經轉入外源基因於植株中，鎖住病原體所產生 的 mRNA ，使之形成雜交 RNA 雙股，以抑制病原體的基因表現。而植物病毒之交互保謢是利 用植物若受一種病毒感染，其它病毒即無法感染的特性行之。因此，我們僅需將會產生病毒 鞘蛋白的基因轉入植株中，此植株即因植物病毒之交互保謢而產生抗病性。如抗胡瓜嵌紋病 素、抗木瓜輪點病毒等基因之轉殖，目前已有許多成功的例子。

延緩採收後老化基因之轉殖

植物老化影響作物品質與貯藏期限甚鉅。據估計，因作物採後不耐貯存而造成之損失高 達 40% 。目前認為造成採後農產品快速老化的因子是農產品產生內生性乙烯，乙烯的形成加 速農產品的成熟、老化。現今由於乙烯整個生化合成途徑已相當了解，因此有許多抗乙烯合 成基因已被分離、選殖，如 ACC 合成酵素基因，我們僅需將 ACC 合成酵素基因的反義基因轉 入植株中，由於此基因的表現，抑制了植物體內正常 ACC 合成酵素基因的表現，使乙烯無法 生合成，而延緩農產品老化。

花色、花形基因之轉殖:

花色常常是決定花卉作物價值的重要指標之一。目前市面上商品化的花卉，皆經自然界 中原生花卉改良、培育而來。若某類花卉的原生種源之花色基因種類少，即會限制該類花卉 培育各式花色潛力，因而影響該花卉普及化。由於生物技術之快速發展，目前已有許多色素 合成基因已被分離、選殖，而且已被應用於花色基因之轉殖上，成功地創造出新的花色品 種，如矮牽牛的磚紅色品種之育成，即轉入一外源花色基因而來。另外，在花形的改造方 面，已有許多控制花形的基因被發現、選殖，如有個稱之為 AG 的基因，在植物中若此基因失 去功能，那麼其花朵之雄蕊與雌蕊皆會變成花瓣，因此，就變成重瓣花。以百合花為例，雖 具艷麗色彩，明顯的花形，但雄蕊之花藥常常困擾著消費大眾，因此若能改造出沒有雄蕊且 又重瓣之百合花，應更受消費者青眛。

控制開花間之基因的轉殖:

植物都有其特定的開花時間，而此時間受外界環境因子，與內在基因所調控。植物可能 因某個基因失去功能，即造成開花時間提早或延遲。目前已有許多影響開花時間的基因被選 殖出來，且應用於轉殖之研究，如 LEAFY 基因從阿拉伯芥中被選殖出來，此基因能促進開花 提早。將之轉入白楊樹，並大量表現，使原本需十幾年才會開花的白楊樹，縮短至六個月就 開花。因此，若能善用調控開花時間之基因，我們就可以從事產期調節或花期調節，以降低 產銷失衡的情形。

另外，還有一些基因對改善農作物品質有幫助，如耐旱、耐寒、耐逆境、固氮及提高光 合作用效率之基因等。當然有些性狀並非由單一基因所控制，是由多個基因所共同調控，利 用重組 DNA 轉殖此類性狀，困難度就相當高。但可預見的，將來會有更多的基因被分離、選 殖，並應用於轉殖研究，以提高作物品質，造福人類。

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