'植物病毒' 脫除技術與原理 ::爼織培養技術

植物病毒脫除技術與原理 多數農作物，尤其無性繁殖的植物，易受病菌侵染。最嚴重的如草莓，能感染 62 種病毒和類菌原體，因此須常更新母株。                蘭花同樣易感染病毒，這也是蘭花外銷主要障礙之一。要除去植物病毒最好的方法是利用種子繁殖，原因是大部份病毒不能通過種子來傳播。可這方法對蘭花生產不合適，因為有保持品質需要，現行蘭花繁殖多採用分生苗。如何利用組織培養技術來進行蘭花脫毒，才是現實可行的方案。                                        脫毒技術的產生源自於人們對病毒在植物體內分佈不均勻的認識。 1940 年人們就發現根莖頂端分生組織與植物其他部分相比病毒含量較低，後來就有人嘗試將莖尖頂端無毒部分切下，通過組織培養的辦法進行繁殖。利用這樣方法 Morel 等人 1952-1955 年獲得了大麗花、天竺葵、馬鈴薯無毒植株。雖然如此，有些植物品種頂端分生組織仍有病毒，莖尖脫毒難以奏效。後來， 1956 年 Thomas 採用分生組織與熱處理相結合的方法，脫毒效率大為提高。到 1970 年代，植物原生質體培養技術的發展，又為植物脫毒技術提供了新的途徑。

一 脫毒技術及其原理"

（ 1 ）莖尖（根尖）組織培養脫毒法

莖尖（根尖）培養之所以能脫毒，是因為植物幼嫩的新生組織與器官中病毒含量較低，生長點前端 0.1 -1.5m m 區域內幾乎不含病毒或含量很少。這種現象有多種可能的原因，一種可能是莖尖（根尖）分生組織中胞間連絲發育不完全，病毒在細胞間的擴散受阻 ; 再者可能是植物莖尖（根尖）細胞分裂過快，病毒復製、擴散速度趕不上莖尖生長速度，結果莖尖（根尖）頂端細胞沒有病毒 ; 還有原因可能是莖尖（根尖）分生細胞有抑制、鈍化病毒的物質，或者是缺少病毒增殖感受點。莖尖培養脫毒方法是在解剖鏡下，用鋒利的解剖刀準確地切取莖尖（根尖），然後將莖尖（根尖）分生組織進行離體培養，再結合病毒檢測，就可以獲得無病毒的植株。莖尖培養中最主要的影響因素就是切取莖尖（根尖）的大小，一般要求莖尖（根尖）長度小於 1m m 。技術上通常切取莖尖（根尖）越小，脫毒效果越好，但是莖尖（根尖）培養成活率變低。

（ 2 ）莖尖微芽嫁接脫毒 對一些組培困難的植物，莖尖截取太小培養不易成功。新的變通方法是在試管中將莖尖嫁接在無毒的砧木上，進行試管培養，愈合成完整的脫毒植株。這種方法在柑橘、蘋果、葡萄等有較多應用。

（ 3 ）熱處理法 熱處理脫毒是根據病毒與植物細胞對高溫的忍耐程度不同，將苗木、接穗或種子放在適當的溫度下處理一段時間，將植物組織中病毒部分地或完全地鈍化而控制其的活動，但很少傷害甚至不傷害植物組織，從而讓植物細胞繼續保持活力加快生長，使生長點附近不帶病毒，從而達到脫毒的目的。熱處理法是利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐性的差異，鈍化病毒，其過程很復雜，與很多因素有關。其中，病毒對溫度敏感性、寄主植物的保衛反應均有可能起一定的作用。熱處理法中，最主要的影響因素是溫度和時間。熱處理可通過熱水浸泡或濕熱空氣進行。熱水浸泡對休眠芽效果較好，濕熱空氣對活躍生長的莖尖效果較好，既能消除病毒又能使寄主植物有較高的存活機會。熱空氣處理比較容易進行，把旺盛生長的植物移入到 1 個熱療室中，在 35~ 40 ℃ 下處理一段時間即可，處理時間的長短，可由幾分鐘到數月不等。熱處理的方法有恆溫處理和變溫處理，處理的材料可以是植株，也可以是接穗。有些植物對高溫敏感，可用冷處理代替熱處理結合莖尖培養來脫毒。如三葉草，將植株放在10 o C 中經過一段時間培養，再取莖尖脫毒培養。同樣方法也有人用於消除馬鈴薯梭狀塊莖類病毒。

（ 4 ）抗病毒藥劑法 目前尚無一種藥劑能完全消除植物體內病毒，但可用一些抗病毒藥劑影響病毒 RNA 的複製形成，干擾病毒的正常生長，從而達到在組織培養中除去病毒的目的。 Ribavirin 是人工合成的對 DNA 病毒或 RNA 病毒有廣譜作用的一種抗病毒醚，有被用來清除蘋果中 CLSV 病毒。另外常用的抗病毒化學藥物有三氮唑核苷（病毒唑）， 5- 二氫尿嘧啶（ DHT ）和雙乙醯 - 二氫 -5- 氮尿嘧啶（ DA-DHT ）。這些藥物常常通過直接注射到帶病毒的植株上，或者加到植株生長的培養基上。這種方法一般要與莖尖培養相結合應用。經過抗病毒藥劑處理的嫩莖，切取莖尖，再進行組織培養，就會提高脫毒率和成活率。採用病毒抑制劑與莖尖培養相結合的脫毒方法，可以較容易的脫除多種病毒，而且這種方法對取材要求不嚴，接種莖尖可大於 1m m ，易於分化出苗，提高存活率。很多植物病毒用一種方法難以奏效，實際工作中常常是幾種方法相互結合。如使用化學藥劑和熱處理結合，可提高脫除病毒的效果。其他有效方法，如利用種子、花藥、胚珠部分，培養無毒苗，對蘭花不適用，這里不作介紹。

二 脫毒效果的檢測方法 盡管我們在脫毒過程中，做了很多清除病毒的處理，取莖尖時也足夠小心，培育出的苗木也仍然可能夾帶有病毒植株。糟糕的是很多植物病毒有一個滯後的復甦期，你很難在小苗期辨別出來。因此，一個有效病毒檢測方法是脫毒成功的重要保證。檢驗植物病毒方法隨生物科技進步不斷改進。最簡單方法是檢查葉和莖是否有病毒特有的症狀。因症狀出現可能要經過相當長的時間才能表現出來，人們就選擇一些對待檢病毒敏感的植物作為指示植物，然而將受檢植物汁液塗抹在指示植物的傷口上，即進行病毒的汁液傳染，傳染過的指示植物經過培養，會較快地顯示病毒症狀。對蘭花而言，多項調查報告顯示，感染情況最普遍，對全球蘭花產業影響最嚴重的，為蕙蘭嵌紋病毒 (CyMV) 及齒舌蘭輪斑病毒（ ORSV ）。這兩種病毒相應的常用指植物為紅藜和千日紅，症狀為紅色或黃色斑點。這就是常說的生物鑑定法。指示植物法简便易行，成本低，但它灵敏性差，所需时间长，难以区分病毒种类，況且還有一些植物病毒長期潛伏不表現出症狀，這就需要血清法、電鏡法、 PCR 技術。 抗血清鑒定法要進行抗原的製備 ( 包括病毒的繁殖，病葉研磨和粗汁液澄清等 ) ，抗血清的採收、分離等。血清可分裝到小玻璃瓶中，貯存在– 15~ – 25 ℃ 的冰凍條件下。測定時，把稀釋的抗血清與未知的病毒植物汁液在小試管內混合，這一反應導致形成可見的沉澱，然後根據沉澱反應來鑒定病毒。此法靈敏度高，獲得檢測結果迅速，是目前檢測病毒的一種好方法。島內已有酵素連接抗體，可進行 蕙蘭嵌紋病毒 (CyMV) 及齒舌蘭輪斑病毒（ ORSV ）免疫測定（ ELISA 法），結果準確可靠。  血清學反應，如果植物體內病毒含量較低，則靈敏度不夠。近年來迅速發展的 PCR 技術則可以檢測很少量病毒分子。對那些已知其核酸序列的病毒，可以人工合成特異的引子，通過 PCR 快速擴增目標病毒基因，迅速確定病毒存在與否。幸運的是 進行 蕙蘭嵌紋病毒 (CyMV) 及齒舌蘭輪斑病毒（ ORSV ） PCR 測定的引子國外已有公開發表，只要一個簡單實驗室即可完成。此外， PCR 微量板雜交法、蛋白質電泳法、嫁接檢測法、 電子顯微鏡檢定法等也可以用來檢測植物病毒，限於篇幅不在這里介紹。當然，上述三種方法正確運用，可以有效地幫助我們篩選出無病毒的蘭花植株。

三 無病毒原種的保存::

無病毒植株不具備額外的抗病毒能力，它們在污染環境中有可能會很快再次感染病毒。為避免再次感染應對溫室和栽培介質進行消毒滅菌。大規模繁殖育苗時，應該種植在與其他苗木相隔離的區域內，使該區域很少或完全沒有重新感染的機會。通過脫毒檢驗的原種可進行離體培養，長期保存繁殖。通過莖尖培養得到的植株一般不發生或較少有變異，但還是應該檢查脫毒苗木是否保持了原有的遺傳品質。病毒脫除是保持蘭花種質的一項重要工作，我們可共同合作，克服這個蘭花發展的障礙，讓臺灣蘭花有更廣闊國際市場。-------------------------------------------------------------------------------

雲嘉南地區為''番茄''主要的栽培區，依台灣農業年報資料 96 年栽培面積達 1,768 公頃 ，佔全國栽培面積的 45.7 ％，常見之病蟲害如病毒病、青枯病、細菌性斑點病、根瘤線蟲、早疫病、晚疫病、黑葉黴病、銀葉粉蝨、斑潛蠅、蚜蟲、番茄夜蛾、甜菜夜蛾等。番茄的病毒病害主要有：番茄嵌紋病毒（ Tomato mosaic virus ； ToMV ）、胡瓜嵌紋病毒（ Cucumber mosaic virus ； CMV ）、番茄捲葉病毒（ Tomato leafcurl virus ； TLCV or Tomato yellow leaf curl virus ； TYLCV ）、馬鈴薯病毒 Y （ Potato virus Y ； PVY ）及番茄斑點萎凋病毒（ Tomato spottd wiltvirus ； TSWV ），病徵依感染的病毒種類、栽培品種及環境因素而異，罹病植株葉片呈現黃綠不均的嵌紋，偶有壞疽條斑或水浸狀斑，或呈凹凸不平、皺縮、畸形，新葉顏色變淡黃、葉片縮小、變細如細繩狀或植株矮小，嚴重者生長停頓，甚至枯死，且番茄病毒病之田間複合感染情況相當普遍，嚴重時罹病株率可高達 100 ％，造成農民嚴重損失。 目前研究顯示番茄種子會帶毒傳播的只有 ToMV ，其他病毒不會經由種子帶毒傳播。農民在番茄果實採收後，蒐集種子須先經由酸處理去除種子的果膠，再經過滾筒乾燥去種毛，但是仍有病毒污染種子，因育苗場或是農民育苗後，種苗就有病毒感染的植株，因此本研究擬建立番茄種子去病毒技術。 蒐集市售種子 共計蒐集 75 個品種，包括農友種苗之農友 301 、明珠、雙福、新光 ... 等 39 品種；美大種苗之黃金減肥小番茄 、黃金減肥大番茄等 4 品種；台灣農產公司之瀧井交配桃麗、大宮 163 等 8 品種；生生種苗之聖運、西施、萬人緣、黃玉等 4 品種；稼穡種苗之包括大牛 606 、紅利 601 、紅利 603 、紅利 623… 等 10 品種；亞蔬品種之亞蔬 4 、 5 、 6… 等 6 品種；其他品種之台南場 - 金豔、地方品種 - 西螺黑柿、試交 2 號。

種子及種苗帶病毒檢測::

一、種子或種苗全量 RNA 的製備 蒐集市售種子，將種子或種苗 ( 放於 1/ 2M S 培養基上萌發 10 天 ) 全量 RNA 之製備則是將種子或種苗植株葉片於液態氮中研磨成粉狀，以 Total RNA Reagent （ GenMark 公司）萃取 RNA ，以 95 ％酒精沉澱後溶解於無菌水中。

二、反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) 偵測 針對番茄嵌紋病毒 (ToMV) 、馬鈴薯 Y 病毒 (PVY) 、胡瓜嵌紋病毒 (CMV) 、番茄斑點萎凋病 (TSWV) ，抽取種子 RNA 進行反轉錄 - 聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) ，本實驗所使用之引子對乃是根據已知之 ToMV 、 PVY 、 CMV 及 TSWV 核苷酸的序列，設計專一性引子，進行 RT-PCR 反應， PCR 反應後產物以電泳法進行分析，其程序乃遵照一般分子生物技術進行。

三、聚合酶連鎖反應（ PCR ）： 針對番茄捲葉病毒 PCR 檢測： 1. 簡易 DNA 的抽取： 取植物葉片 0.2g ，加入 2m lTE 緩衝液（ 50M m Tris-HCl, pH8.0, 10m M EDTA, pH8.0 ），磨碎離心 14000g 、 30 分鐘，吸取 50μl 上清液至微量離心管中，至於 4 ℃ 冰箱 30 分鐘，去除上清液，再用 200μl TE 緩衝液清洗微量離心管 3 次，之後微量離心管上會吸附 DNA ，直接進行聚合酶連鎖反應（ PCR ）檢測。

2.

聚合酶連鎖反應（ PCR ）： 番茄捲葉病毒由專一性引子對（ GCP1/GCP2 ）國立中興大學胡仲棋老師提供，進行 PCR 反應。反應完成後進行電泳法進行分析，其程序乃遵照一般分子生物技術進行。

四、種子及種苗檢測結果 抽取種子 DNA 進行 RT-PCR 偵測 TYLCV ；另外抽取種子 RNA 進行 PCR 偵測 ToMV 、 CMV 、 PVY 及 TSWV ，電泳結果如下： 本研究共蒐集市售番茄種子 75 個品種，共計檢測 75 批種子及 75 批種苗，檢測方法為番茄嵌紋病毒 (ToMV) 、馬鈴薯 Y 病毒 (PVY) 、胡瓜嵌紋病毒 (CMV) 、番茄斑點萎凋病 (TSWV) ，抽取種子 ( 苗 )RNA 進行 RT-PCR ，另番茄捲葉病毒 (TYLCV) 抽取種子 ( 苗 )DNA 進行 PCR ，檢測結果種子感 ( 污 ) 染番茄捲葉病毒（ TYLCV ） 2.3 ％，番茄嵌紋病毒（ ToMV ）為 3.4 ％，胡瓜嵌紋病毒（ CMV ）為 0.5 ％，馬鈴薯 Y 病毒 (PVY) 為 0.2 ％，並無檢測到番茄斑點萎凋病 (TSWV) 。種苗部分感 ( 污 ) 染番茄嵌紋病毒（ ToMV ）為 3.16 ％，感 ( 污 ) 染番茄捲葉病毒（ TYLCV ） 1.88 ％，並無檢測到其他病毒 ( 表一 ) 。

表一、番茄種子種苗帶毒率檢測

病毒名稱

ToMV

CMV

PVY

TSWV

TYLCV

種子帶病毒百分率

3.4

0.5

0.2

0

2.3

種苗帶病毒百分率

3.16

0

0

0

1.88

番茄種子只會攜帶番茄嵌紋病毒 (ToMV) ，但是在本實驗中除了 TOMV 外，其他三種病毒 - 番茄捲葉病毒 (TYLCV) 、馬鈴薯 Y 病毒 (PVY) 、胡瓜嵌紋病毒 (CMV) ，均有檢測到，而種苗上有檢測到 TYLCV ，病毒到底是感染種子內部，或污染種子外皮，値得再進一步去探討。

番茄種子去病毒技術之研究

一、磷酸三鈉處理 蒐集番茄園中罹病毒果實，將番茄種子 10 g 裝於 3 ㎝ ×6 ㎝的紗布袋，置於不同濃度： 12.5 ％、 15 ％及 20 ％的磷酸三鈉溶液浸泡，分別處理不同時間： 15 分、 20 分、 25 分及 30 分，處理完後以流水沖洗 1 小時，再將種子以 1 ％次氯酸鈉消毒後，置於 1/2 MS 10 天使其萌發，調查種苗發芽率及帶病毒率。番茄種子以 12.5 ％之磷酸三鈉處理 30 分鐘及 15 ％之磷酸三鈉處理 20 分鐘，去病毒最為有效，完全檢測不到帶病毒之種苗，且其發芽率達 95 ％以上。 二、乾熱處理 蒐集番茄園中罹病毒果實，蒐集種子後，略為陰乾，以乾熱處理，再將種子以 1 ％次氯酸鈉消毒後，置於 1/2 MS 10 天使其萌發，調查種苗發芽率及帶病毒率，結果，不預熱處理，以 70 ℃ 處理 72 小時，發芽率 83 ％，種苗帶病毒率為 2.5 ％，以 48 ℃ 預熱處理 6 或 12 小時，再以 68 或 70 ℃ 處理 24 小時，結果顯示不論預熱 6 或 12 小時， 68 ℃ 處理的發芽率可達 95 ％以上且種苗帶病毒率為 1.2 ％以下；另以 50 ℃ 預熱處理 6 或 12 小時，再以 68 或 70 ℃ 處理 24 小時，結果顯示不論預熱 6 或 12 小時， 68 ℃ 處理的發芽率可達 95 ％以上且種苗檢測不到病毒。 另有以 52 ～ 60 ℃ 預熱處理，再以 62 ～ 70 ℃ 乾熱處哩，但都會影響發芽率且帶病毒率偏高，故未列於表中。由結果可知不預熱處理直接 70 ℃ 處理三日由於發芽率偏低，不建議採用，建議以 50 ℃ 預熱 6 小時後，再以 68 ℃ 處理 24 小時去病毒效果較佳，完全檢測不到帶病毒之種苗，可推薦種子生產公司採用。

-Tomato Seeds-

*Na3PO4: (10%x30min 15%x20min 20%x10min )*

*Heater : (50Cx6hr 68Cx24hr)

-Orchids- Tissue Culture :

1 Na3PO4: (10%/PH10-11 x 30min)

2 Heater : ( 50C Sterile AQ. Med. x 1 hr x 2 hr x 3 hr)

3 Cool Culture : ( 20C Culture Med. x 30 Day)

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